Rst 02806 инструкция

Диагностическое применение зондов рецептора глюкагона. В другом аспекте данного изобретения обеспечены зонды и праймеры для детектирования рецепторов глюкагона. В одном варианте изобретения обеспечены зонды, которые способны гибридизоваться с ДНК или РНК рецептора глюкагона.

Среды отсасывали из клеток и клетки промывали 3 раза холодным 4oC PBS. Глутаровый альдегид удаляли и клетки ополаскивали 3 раза PBS. Предметные стекла сушили на воздухе в течение 1 часа при комнатной температуре, погружали в жидкую фотографическую эмульсию Eаstman Коdak Co. Стекла затем помещали в светонепроницаемый бокс на 72 часа при 4oС. Клетки, способные связывать глюкагон, обнаруживали при 2,5Х увеличении при ярком освещении поля. Одни пул, 57, был идентифицирован как пул, содержащий клетки, способные связывать глюкагон.

Примеры получения изложенных выше изменений описаны Walder еt аl. Gеnе ; Bauer еt аl. Gеnе; Craik Вiо Techniques, Jаnuаry; Smith еt аl.

Короткие Rst 02806 инструкция, например, из 12 оснований могут быть получены синтетическим путем. Более длинные зонды, приблизительно от 75 оснований до менее 1,5 кб т. Зонды длиной более 1,5 кб обычно более легко амплифицировать путем трансфекции клетки плазмидой, содержащей соответствующий зонд, выращивания трансфицированных клеток до больших количеств и очистки соответствующей последовательности из трансфицированных клеток.

Альтернативно антигенсвязывающие сайты вариабельный район могут быть либо соединены с другим, совершенно отличающимся белком или встроены в такой белок, что приводят к образованию нового белка с антигенсвязывающими сайтами Rst 02806 инструкция, а также с функциональной активностью второго белка.

PCR реакцию проводили в виде 40 циклов 1 минута при 95oC, 1 минута при 42oС и 2 минуты при 72oC с последующим инкубированием в течение 7 минут при 72oС. PCR продукт н.

Предпочтительными промоторами для применения в дрожжах являются промоторы из дрожжевых гликолитических генов Нit Zeman et al. Patent или гены алкогольдегидрогеназы Young еt аl. В этой связи особенно предпочтительными промоторами являются TPLI промотор Kawasaki, U. Раtеntи ADHC промотор Pussel et аl. Единицы экспрессии могут также содержать терминатор транскрипции. Предпочтительным является TPLI терминатор транскрипции Alber and Kawasaki, ibid.

В частности известно, что в то время как инсулин быстро снижает уровни глюкозы в крови, глюкагон уравновешивает эти эффекты, способствуя повышению уровней глюкозы в крови. Взаимодействия глюкагона инсулина очень важны для поддержания уровней глюкозы внутри тела.

USA Отдельные трансформанты, экспрессирующие аналог глюкагона, можно затем клонировать, как описано выше, или накапливать. Соединения экспонируют с рекомбинантным рецептором глюкагона в присутствии агониста глюкагона при условиях и в течение времени, достаточных для прохождения связывания соединения с рецептором и ассоциированного с ним ответа через метаболический путь.

Антитела считают специфически связывающимися, если они связываются с рецептором глюкагона с Кa большей или равной М Аффинность моноклинального антитела или партнера связывания может быть легко определена специалистом в этой области см.

Затем применяют отбор при помощи лекарственного средства для селекции по росту клеток, которые экспрессируют стабильно селектируемый маркер. Для клеток, трансфицированных амплифицируемым селектируемым маркером, концентрацию лекарственного средства можно увеличивать ступенчато для селекции на повышенное число копий клонированных последовательностей, т. Клетки, экспрессирующие введенные последовательности, отбирают и подвергают скринингу на продуцирование целевого белка в желаемой форме и на желаемом уровне.

Изобретение касается рецептора глюкагона. Предложена изолированная молекула ДНК, кодирующая рецептор глюкагона или пептид рецептора глюкагона. ДНК-конструкция обеспечивает экспрессию изолированной молекулы ДНК и встраивается в линию клеток COS или ВНК. Также предложен способ получения рецептора глюкагона, предусматривающий культивирование линий клеток COS или ВНК и выделение целевого продукта. В изобретении представлено также изолированное моноклональное антитело, специфически связывающееся с рецептором глюкагона и блокирующее связывание глюкагона с рецептором глюкагона.

Супернатанты из таких клеточных линий можно затем обработать при помощи различных процедур очистки для выделения пептида рецептора глюкагона. Например, сначала супернатант можно концентрировать при помощи коммерчески доступных фильтров для концентрирования белков, таких как Amicon или Milliроrе Реllсоn ультрафильтрационная единица. После концентрирования концентрат можно нанести на подходящий очищающий матрикс, такой как, например, антитела против рецептора глюкагона или глюкагон, связанные с подходящим носителем.

Таким путем число клонированных последовательностей ДНК, которое должно быть трансфицировано в клетку-хозяин, может быть сведено к минимуму, и общий выход биологически активного белка может быть оптимизирован. Подходящими дрожжевыми векторами для применения в данном изобретении являются векторы YRр7 Struhl еt аl. USA, YЕр13 Вrоасh еt al. Patentкоторый включен здесь в виде ссылки pJDB и pJDВ Beggs, Natureи их производные.

В частности связывание глюкагона с его клеточным рецептором активирует аденилатциклазу для продуцирования сАMР, повышая таким образом уровни внутриклеточного сАМР.

Трансфицированные клетки анализировали после 72 часов путем связывания с глюкагоном с последующей эмульсионной радиографией McMahan et аl. Положительные пулы последовательно разбивались, пока не был изолирован отдельный клон. Плазмида, полученная из этого клона, обозначенная как рLJ4, содержит приблизительно 2,0 т. В других аспектах данного изобретения обеспечены способы выделения и клонирования человеческого рецептора глюкагона.

Зонды данного изобретения могут состоять либо из ДНК, либо из РНК и Rst 02806 инструкция иметь в длину всего лишь приблизительно 12 нуклеотидов, обычно нуклеотидов, но могут быть и такими большими, как вся последовательность рецептора глюкагона.

Поликлональные антитела можно легко получить квалифицированному специалисту из многих теплокровных животных, таких как лошади, коровы, козы, овцы, собаки, цыплята, кролики, мыши или крысы. Вкратце, рецептор глюкагона применяют для иммунизации животного при помощи внутрибрюшинной, внутримышечной, внутриглазной или подкожной инъекций.

Конструкции этого типа известны специалистам например, Lеvinsоn аnd Simonsen, U. Предпочтительно бывает добавление дополнительной ДНК, известной как "ДНК-носитель", к смеси, которая вводится в клетки. Трансфицированным клеткам млекопитающих позволяют расти в течение периода времени обычно дней, после чего они начинают экспрессировать целевую последовательность целевые последовательности ДНК.

При связывании агониста рецептора глюкагона повышенные уровни сАМР индуцируют экспрессию люциферазы. Люциферазу экспонируют с люциферином измеряют фотоны, высвобождаемые во время окисления люциферина люциферазой. В других вариантах изобретения активация ответной реакции приводит к увеличению внутриклеточной концентрации свободного кальция. Для определения концентрации свободного внутриклеточного кальция можно применять различные тесты, например Rst 02806 инструкция Calcim fluor Quinz, описанный Charest et al.

Для амплификации выбранной последовательности могут быть Rst 02806 инструкция различные способы, в том числе, например, амплификация РНК cм. Patеnt ; и амплификация ДНК с применением полимеразной цепной реакции PCR см.

Клетки, Rst 02806 инструкция этим критериям, можно затем клонировать и оценивать на производительность. Предпочтительными прокариотическими клетками-хозяевами для применения в Rst 02806 инструкция данного изобретения являются штаммы бактерии Escheriсhiа соli, хотя также можно использовать Baccillus и другие роды.

Детальное описание изобретения Как отмечено выше, данное изобретение обеспечивает изолированные молекулы ДНК, кодирующие рецепторы глюкагона. Считают, что в их природной конфигурации рецепторы глюкагона существуют в виде мембраносвязанных белков, состоящих из внеклеточного аминоконцевого домена, а также нескольких наружных и внутренних доменов меньшей величины см.

Patent с названием Rst 02806 инструкция Antibody Binding Sites". Вкратце, в одном варианте сегменты ДИК, кодирующие антигенсвязывающие домены, специфические для рецептора глюкагона, амплифицируют из гибридом, продуцирующих специфически связывающие рецептор моноклональных антитела, и вводят Rst 02806 инструкция в геном клетки, продуцирующей человеческие антитела см.

Например, некоторые клеточные ответные реакции, такие как увеличение уровней внутриклеточного кальция, могут инициироваться связыванием глюкагона с его рецептором в отсутствие сАМР- или инозитфосфатных сигналов. Изолирование выделение клонов кДНК рецептора глюкагона Как отмечено выше, данное изобретение обеспечивает изолированные молекулы ДHK, Rst 02806 инструкция рецепторы глюкагона. Вкратце, геномные или кДНК-молекулы, кодирующие рецепторы глюкагона, могут быть получены из библиотек, приготовленных из клеток и тканей согласно процедурам, описанным ниже и в примерах.

Клетки откручивали и среду выбрасывали. Первый глицерериновый исходный раствор титровали и засевали пулов из колоний на чашку. После роста колоний каждую чашку выскребали в 10 мл LB-Аmр. Брали аликвоту клеток из каждого пула для применения в приготовлении плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК получали из каждого пула клеток и полученную ДНК расщепляли РНКазои Boehringer Mannheim, Indianopolis, Ind. Цлазмидную ДНК из каждого пула трансфицировали в СОS-7 клетки АТСС СRL и трансфектанты скринировали на присутствие рецепторов глюкагона при помощи теста связывания I-глюкагона.

Как отмечено выше, данное изобретение обеспечивает способы детектирования антагонистов глюкагона. В контексте данного изобретения антагонистом называют молекулу, способную связываться с рецептором, но Rst 02806 инструкция стимулирующую или снижающую стимуляцию отвечающего на глюкагон пути внутри клетки. В частности антагонисты глюкагона обычно идентифицируют по их способности связываться с рецептором глюкагона и вследствие этого снижать стимуляцию отвечающего на глюкагон пути метаболизма внутри клетки.

Отбирали комплементарные цепи ДНК, большие чем н. Выделение кДНК крысиного Rst 02806 инструкция глюкагона при помощи амплификации с применением полимеразной цепной реакции PCR-амплификации. КДНК печени крыс использовали в качестве матрицы для амплификации последовательностей нуклеотидов рецептора глюкагона с применением вырожденных олигонуклеотидов ZC и ZC; SEQ ID 9 и 8 соответственносоответствующих районам высокой консервативности среди членов семейства генов секретина.

В одном варианте эти антитела представляют собой моноклональные антитела. В дополнительном варианте обеспечены моноклональные антитела, способные блокировать связывание глюкагона с рецептором глюкагона. Также обеспечены гибридомы, продуцирующие описанные выше моноклональные антитела. Еще в одном аспекте данного изобретения обеспечен способ обнаружения Rst 02806 инструкция антагонистов глюкагона, предусматривающий стадии а экспонирования соединения в присутствии агониста глюкагона с рекомбинантным рецептором глюкагона, связанным с путем ответной реакции, при условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы произошло Rst 02806 инструкция соединения с рецептором Rst 02806 инструкция произошла ассоциированная ответная реакция через путь метаболизма и b детектирования уменьшения в стимулировании ответного пути, вызываемого связыванием испытуемого соединения с рецептором глюкагона, по сравнению со стимулированием ответного пути одним агонистом глюкагона, и определение из этих данных присутствия антагониста глюкагона.

Rst 02806 инструкция последовательность обладает высокой антигенностью и обеспечивает эпитоп для связывания специфическими моноклональными антителами, делая возможной быструю очистку экспрессируемого рекомбинантного белка. Эта последовательность также специфически расщепляется энтерокиназой бычьей слизистой оболочки при Rst 02806 инструкция, следующем непосредственно после пары Аsр-Lys. Для удобства могут быть приготовлены многочисленные конструкции ДНК, включающие в себя полные последовательности или части последовательностей нативного или вариантного рецепторов глюкагона, обсужденных выше.

Реакционную смесь готовили таким образом, что она содержала 20,0 мкл 4х буфера для полимеразы I мМ Rst 02806 инструкция, рН Rst 02806 инструкция, мМ КСl, 25 мМ MgCl2, 50 мМ NН4 2SO44,0 мкл мМ дитиотреитола, 1,0 мкл раствора, содержащего 10 мМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 3,0 мкл. Параллельную реакцию, в которой аликвоту Rst 02806 инструкция мкл смеси для синтеза второй цепи метили путем добавления 10 мкКи 32P.

Как было отмечено выше, можно использовать множество тестов для обнаружения антител, которые блокируют или ингибируют связывание глюкагона с рецептором глюкагона, в том числе inter alia, ингибиторные и конкурентные тесты, Rst 02806 инструкция выше. В одном варианте моноклональные антитела полученные, как описано выше тестируют на связывание с рецептором глюкагона в отсутствие глюкагона, а также в присутствие различных концентраций глюкагона.

Конструкции ДHК данного изобретения содержат первый сегмент ДНК, кодирующий рецептор глюкагона, оперативно соединенный с дополнительными сегментами ДНК, необходимыми для экспрессии первого сегмента ДНК. В контексте данного изобретения дополнительные сегменты ДНК в основном будут включать в себя промоторы и терминаторы транскрипции и могут, кроме того, содержать энхансеры и другие элементы.

Sсiеnсе, для получения Rst 02806 инструкция полной длины. Затем библиотеку, содержащую приблизительно 1. Затем плазмидные ДНK, полученные из пулов, содержащих клонов, трансфицировали в COS-7 клетки, отбирали и выращивали на предметных стеклах для микроскопа.

В контексте данного изобретения конструкцией ДНК называют Rst 02806 инструкция ДНК или Rst 02806 инструкция такой молекулы одноцепочечной или двухцепочечнойкоторая была модифицирована таким образом, что она содержит сегменты ДНК, объединенные и помещенные рядом таким образом, что образуется молекула, которая не существовала в природе.

Как только титр животного достигнет плато с точки зрения реактивности антител с рецептором глюкагона, большие количества поликлональных антител можно легко получать либо еженедельным извлечением крови, либо после забоя животного. Моноклональные антитела могут быть также легко получены при помощи хорошо известных способов см. Parent RE, и ; см.

Предпочтительные векторы могут также содержать энхансерные последовательности, такие как энхансер SV40. Экспрессирующие векторы могут также содержать последовательности, кодирующие Rst 02806 инструкция VA аденовируса.

Ростовая среда будет селектировать клетки, содержащие конструкцию конструкции ДНК, например, при помощи селекции с применением лекарственного средства или селекции при недостаточности основного питательного элемента, что дополняется селектируемым маркером на конструкции ДНК или на другом векторе, котрансфицируемым вместе с конструкцией ДНК.

Клетки культивируют в соответствии со стандартными способами в культуральной среде, содержащей питательные элементы, необходимые для роста выбранных клеток-хозяев. Известно много подходящих сред, которые обычно содержат источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины и минеральные соли, а также другие компоненты, например факторы роста или сыворотку, которые могут быть необходимы для определенных клеток-хозяев.

В другом варианте обеспечены вирусные векторы, которые направляют экспрессию кДНК рецептора глюкагона. Вирусными векторами, пригодными для применения в данном изобретении, среди других являются Rst 02806 инструкция векторы вируса осповакцины U. Как отмечалось выше, вирусные векторы данного изобретения могут быть использованы в лечении болезненных состояний, при которых либо избыточно экспрессируется рецептор глюкагона, либо экспрессируется мутантный рецептор глюкагона или в случаях, когда не экспрессируется рецептор глюкагона.

Способы получения рекомбинантных белков во множестве прокариотических и эукариотических клеток-хозяев известны специалистам в этой области см. Academic Press, Sаn Diego, Calif. Как правило, клетку-хозяина выбирают на основе ее способности Rst 02806 инструкция целевой белок на высоком уровне или на основе ее способности проводить по меньшей мере некоторые из стадий процессинга, необходимых для биологической активности этого белка.

I : Материал, собранный из верхних интерфаз объединяли и учитывали после определения чистоты островков при помощи окрашивания дитиазоном. Средний диаметр островков был мкм. Кроме того, выделенные островки обнаруживали как первую, так и вторую фазы функции секреции инсулина после перфузии либо высокой концентрацией глюкозы, либо изобутилметилксантином IВМХ.

Выбор размера зонда зависит от его применения. Например, для определения присутствия различных полиморфных форм рецептора глюкагона внутри индивидуума Rst 02806 инструкция зонд, содержащий фактически всю длину кодирующей последовательности рецептора глюкагона. Зонды рецептора глюкагона могут быть применены для идентификации полиморфизмов, связанных с геном рецептора глюкагона см.

Известны многие такие миеломные клеточные линии, и они могут быть получены, например, из American Type Culture Collection ATCCRockville, Maryland см. Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 6-th ad. Особенно предпочтительными слитыми линиями являются NS-1 ATCC TIB 18 и Р3.

Затем животному дают конечную инъекцию рецептора глюкагона или пептида рецептора глюкагона и через дня убивают. В это время у животного берут селезенку Rst 02806 инструкция лимфатические узлы и Rst 02806 инструкция в клеточную суспензию проведением органов через сито или разрушением мембран селезенки или лимфатических узлов, окружающих клетки.

Секреторные сигнальные последовательности могут быть использованы по отдельности или могут быть скомбинированы. Например, первая секреторная сигнальная последовательность может применяться с последовательностью, кодирующей третий домен Ваrriеr описанный в U. Раtеntна который дается полная ссылка. Для экспрессии молекулу ДНК, кодирующую рецептор глюкагона, встраивают в подходящую конструкцию ДНК, которую в свою очередь используют для трансформации или трансфекции подходящих клеток-хозяев для экспрессии.

Антагонисты глюкагоны, которые могут быть обнаружены, как описано выше, могут быть очищены ионообменной и распределительной хроматографией, как описано, например, Coy et al. Peptides Structure and Function, Pierce Сhеmiсаl Company, Rосkfоrоd IL. Дополнительная очистка может быть достигнута с применением обычных способов химической очистки, таких как жидкостная хроматография, градиентное центрифугирование и гель-электрофорез и.

В контексте данного изобретения "рецептором глюкагона" называют такие белки и подобные им производные. Производные могут быть аллельными разновидностями и генетически сконструированными вариантами, содержащими консервативные аминокислотные замены или минорные добавления, замены или делеции аминокислот. Рецепторы глюкагона данного изобретения способны связывать глюкагон и осуществлять трансдукцию этого сигнала в клетку.

В контексте данного изобретения агонистами глюкагона являются соединения в том числе и сам глюкагонспособные связываться с рецептором глюкагона и стимулировать восприимчивый к глюкагону путь внутри клетки. При помощи таких способов можно скринировать множество соединений.

График гидрофобности крысиного рецептора глюкагона изображен в фиг. Считают, что рецепторы глюкагона имеют структуру, показанную в фиг. В частности считают, что эти рецепторы содержат внеклеточный аминоконцевой домен, три внеклеточных домена в виде петель и Rst 02806 инструкция внутриклеточных домена в виде петель, разделенных трансмембранными доменами.

В одном из вариантов эритроциты затем лизируют путем добавления гипотонического раствора с последующим моментальным возвратом к изотоничности. В другом варианте подходящие для получения моноклональных антител клетки получают при помощи техники иммунизации in vitro. Вкратце, животное умерщвляют и клетки селезенки и лимфатических узлов удаляют, как описано выше. Получают суспензию отдельных клеток и эти клетки помещают в культуру, которая содержит форму рецептора глюкагона, пригодную для генерирования иммунной ответной реакции, как описано выше.

Краткое изложение сущности изобретения Согласно одному аспекту данного изобретения предложены выделенные молекулы ДНК, кодирующие рецептор глюкагона. Применяемый здесь термин "изолированная молекула ДНК относится к молекулам ДНК или последовательностям ДНК, которые отделены, помещены отдельно от других клеточных компонентов. Например, молекула ДНК изолирована, если она отделена от других молекул ДНК, в том числе от других хромосомных последовательностей, с которыми она природно ассоциирована в геноме и, в частности, свободна от других структурных генов.

В следующем варианте рецепторы глюкагона могут быть слиты с другими пептидами, облегчающими очистку или идентификацию рецепторов глюкагона. Например, рецептор глюкагона можно получить Rst 02806 инструкция виде слитого белка с FLAG-полипептидной последовательностью см.

Для целей данного Rst 02806 инструкция зонды "способны гибридизоваться" с ДНК рецептора глюкагона, если они гибридизуются либо при высокой строгости, либо при Rst 02806 инструкция строгости см. Предпочтительно, чтобы зонд мог быть применен для гибридизации с подходящими нуклеотидными последовательностями в присутствии 6. Последовательности зондов построены предпочтительно таким образом, чтобы была возможна гибридизация с последовательностями Rst 02806 инструкция рецептора глюкагона, но не с последовательностями ДНК секретина, кальцитонина или рецептора паратиреоидного гормона.

Дополнительные применения нуклеотидных последовательностей рецептора глюкагона. Еще в одном аспекте данного изобретения обеспечены вирусные векторы, которые могут быть использованы для лечения заболеваний, при которых рецептор глюкагона или мутантный рецептор глюкагона избыточно экспрессируется или при которых не экспрессируется рецептор глюкагона.

В предпочтительном варианте гены, кодирующие вариабельный район, из гибридомы, продуцирующей целевое моноклональное антитело, амплифицируют с применением олигонуклеотидных праймеров для вариабельного района. Эти праймеры могут быть синтезированы специалистами или могут быть приобретены из коммерчески доступных источников. Stratacyte La Jolla, Саlif. VL и CL районов. Затем эти векторы могут быть введены в Е. При помощи этих способов можно получить большие количества одноцепочечного белка, содержащего слитые VH и VL домены см.

Тесты аденилатциклазной активности можно выполнять, например, с Rst 02806 инструкция способа, описанного Lin еt аl. Эти способы измеряют стимулирование сАMР по сравнению с нативным глюкагоном и обычно предусматривают экспонирование препарата клеток, экспрессируюцих биологически активный рекомбинантный рецептор глюкагона, со смесью глюкагона и тестируемого соединения в присутствии радиоактивно меченого АТР. Альтернативно образование сАMР может быть легко измерено при помощи способов, хорошо известных в этой области, в том числе, например, способами, описанными Salomon еt аl.

Альтернативно можно использовать для очистки рецептора или пептида анионо- или катионообменные смолы. Наконец, стадии жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой RP-HPLC могут быть применены для дальнейшей очистки пептида рецептора глюкагона. Пептид рецептора глюкагона считают "изолированным" Rst 02806 инструкция очищенным в контексте данного изобретения, если детектируют только одну полосу при анализе в ПААГ-ДСН с последующим окрашиванием при помощи Кумасси бриллиантового синего.

После нескольких повторных иммунизации берут небольшие Rst 02806 инструкция сыворотки и тестируют их на реактивность с рецептором глюкагона. Можно использовать множество тестов для детектирования антител, специфически связывающихся с рецептором глюкагона. Примеры тестов описаны в деталях в Antibodies: A Laboratory Manual, Harbow and Lane eds.

Предпочтительным агентом для контроля рН является гидроксид натрия. Предпочтительными буферными агентами являются янтарная кислота и Bis-Tris Sigma Chemical Co. Вследствие тенденции дрожжевых клеток-хозяев гипергликозилировать гетерологичные белки, может быть предпочтительно экспрессировать рецепторы глюкагона данного изобретения в дрожжевых клетках, имеющих дефект в гене, необходимом для связанного с аспарагином гликозилирования.

Затем фибронектин разбавляли в 2 раза дистиллированной водой. Тягучий нерастворимый осадок вынимали стеклянной палочкой. Фибронектин подвергали FPLC через 50 Rst 02806 инструкция колонку DЕАЕ FF Sepharose Pharmacia LKB Вiotесhnоlоgу Inc. После того как колонку промывали 10 мМ Трис, рН 8,1, 50 мМ NаСl до получения пробы фона, фибронектин элюировали градиентом соли до 10 мМ Трис, рН 8,1, мм NaCl. Фракции собирали, аликвоты фракций подвергали электрофорезу на полиакриламидных гелях и гели анализировали окрашиванием Кумасси синим и анализом Вестерна.

Другими фармацевтически приемлемыми солями являются Rst 02806 инструкция лимонной, янтарной, молочной, соляной и бромистоводородной кислот. Парентеральные композиции могут быть приготовлены в виде водных изотонических растворов с рН между 5,6 и 7,4. Подходящими изотоническими растворами могут быть растворы хлорида натрия, декстрозы, борной кислоты-тартрата натрия и полиэтиленгликоля. Терапевтические дозы антагонистов могут вводиться одновременно с инсулином либо в одной и той же композиции, либо в отдельных композициях.

Rst 02806 инструкция иммунизация может быть внутрибрюшинной, внутримышечной, внутриглазной или подкожной. Между одной и тремя неделями после исходной иммунизации животное можно реиммунизировать повторной иммунизацией. Затем кровь и сыворотку животного тестируют на связывание с рецептором глюкагона при помощи описанных выше тестов. Дополнительные иммунизации могут проводиться до тех пор, пока животное не выйдет на плато по его реактивности с рецептором глюкагона.

После инкубирования пробу центрифугировали при g в течение 15 минут при 4oC для удаления нерасщепленной агарозы. Затем осаждали кДНК в супернатанте этанолом. Полученную кДНК клонировали в векторе p ZCEP E. Плазмиду рZСЕР, которую переводили в линейную форму расщеплением при помощи Есо RI и Xho, лигировали с Есо RI-Xho I-кДНК. Полученные плазмиды вводили электропорацией в клетки штамма Е. Синтез кДНК клеток панкреатических островков человека. Клетки островков выделяли из поджелудочных желез человека, полученных из доноров трансплантируемых органов, для которых не было подходящего реципиента.

Реакционные смеси для синтеза первой цепи инкубировали при 45oC в течение 45 минут с последующей минутной инкубацией при 50oC. Невключенные нуклеотиды удаляли из каждой реакции двойным осаждением кДНК в присутствии 6 Rst 02806 инструкция гликогена в качестве носителя, 2,5 М ацетата аммония и 2,5 объемов этанола. Немеченую кДНК ресуспендировали в 50 мкл воды и применяли для синтеза второй цепи.

В частности сообщалось, что глюкагон связывается с рецепторами в мембране гепатоцита печеночной клеткикоторые соединены через G-белок с фосфолипазой С. При стимулировании этот белок вызывает распад фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата с образованием вторичных мессенджеров посредников инозиттрифосфата и 1,2-диацилглицерина см.

Многие технологии можно использовать для обеспеченного здесь способа, в том числе, например, применение полимеразной цепной реакции РСR для амплификации последовательностей, кодирующих рецептор глюкагона пример 4которые затем могут быть использованы в идентификации библиотек, которые содержат последовательности, кодирующие человеческий рецептор глюкагона с последующим клонированном этого рецептора пример 5.